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    符合中国国情的AAID分子诊断新法

    日期:2010-06-04 13:52:56 来源:中华检验医学网 点击:

      近年虽然许多新型强力的抗生素不断问世,但氨基糖苷类抗生素以其价格低廉、抗菌谱广、杀菌作用快等特点,仍然在临床上广泛使用(特别是用于治疗革兰氏阴性杆菌感染)。如何避免氨基糖苷类抗生素的耳毒性便成为临床医生无法回避的难题。记者为此采访了解放军总医院聋病分子诊断中心戴朴主任。戴朴主任介绍了他们新研制的分子诊断方法在预防AAID中的积极作用。

       AAID分子诊断新法填补国内空白

        戴朴主任告诉记者,大部分氨基糖苷类抗生素致聋患者(AAID)存在线粒体(mt)DNA12SrRNA基因第1555位A→G均质性点突变,这种突变增加了患者对氨基糖苷类抗生素耳毒性的敏感性,使得单次剂量的药物应用即可导致携带此突变个体的重度听力损失(一针致聋!)。因此,对线粒体基因突变的诊断(即分子诊断),便成为AAID防治的重要措施。

        但是,对mtDNAA1555G突变的检测,目前国际上最常用的是Alw26酶切配合序列分析法,由于Alw26酶是一种稀有罕见酶,世界上仅美国的两家生物公司供应,其进口价格昂贵,定购周期较长;且这种酶只切野生型,不切突变型,所以,这种酶切法不符合中国国情,不宜在国内推广。

        戴主任说,解放军总医院聋病分子诊断中心为此专门研制发明了新的AAID分子诊断方法--“mtDNAA1555G突变检测试剂盒”,从而有望在国内大面积开展mtDNAA1555G突变检测提供了技术条件。

        戴朴主任随后对新方法研制的理论基础即AAID的遗传特性进行了分析。

        线粒体基因的遗传特性

        戴主任解释道,mtDNA是独立于细胞核染色体外的基因组,具有自我复制、转录和编码功能。mtDNA的遗传特点比较独特,它总是由母亲传递给下一代的所有个体而不与父源的线粒体发生交换和重组,而且mtDNA的基因排列紧凑,没有内含子,个别基因之间还可以有部分区域重叠,任何突变都会累及到基因组中的一个重要功能区域,所以mtDNA的突变率较核DNA高出10倍。

        mtDNA的另一个特征是在不同生物个体之间,多态现象非常普遍。有研究表明,在全世界范围内,任意两个人的线粒体之间,平均有61.6个碱基对不同。这也许是mtDNA的突变率明显比核基因突变率高的另一原因。此外,mtDNA还有一个特征:遗传密码与核基因略有不同,其线粒体翻译系统的解码机制也有其自身特点。

        一般情况下每个细胞中有上百个线粒体,每个线粒体内又含有2~10个mtDNA分子,因此,每个细胞中都含有许多线粒体DNA分子的拷贝。在正常情况下,多数人都只有一种野生型线粒体DNA的基因单体型,当有一部分mtDNA发生突变时,细胞内就同时有野生型和突变型两种类型的mtDNA,这给人们对线粒体疾病的基因研究增加了难度。

        AAID的可预防性

        据戴主任介绍,他们中心研究的100余个遗传性耳聋家系中有30个是母系遗传耳聋家系,检测结果证明这些家系存在母系直接传递的mtDNA1555A→G点突变。这种由A1555G突变引起的耳聋属于双侧对称性、以高频听力下降为主的感音神经性耳聋,虽然同是线粒体A1555G突变的携带者,但其具体的临床表现型却是多种多样的。推测主要有三个原因可调节表现型的表达:第一个是环境因素即氨基糖苷类抗生素的应用;第二个是mtDNA的突变或多态可能会影响A1555G突变的表现型;第三个是核基因的调节。

        戴主任接着说,尽管由A1555G突变引起的耳聋可能自然出现,但是绝大多数的A1555G携带者是在使用了氨基糖苷类抗生素后出现耳聋的。尤其在我国AAID患者和家系中这种情况普遍存在。携带此突变的个体在应用不同剂量的氨基糖苷类抗生素后几乎均可发生严重的听力损失,是后天获得性耳聋发生的重要原因。鉴于这一耳聋有明确的基因变化和诱发因素,使得这种耳聋成为可以预防的疾病。其关键的预防环节在于通过检测发现携带mtDNAA1555G突变的个体,绝对禁止此类个体接触氨基糖苷类抗生素,从而避免严重耳毒性反应的发生。

        新的mtDNAA1555G突变检测方法

        戴主任强调,这种新的分子诊断方法,成本低、使用方便、结果可靠,可以在广大人群中、特别是孕产妇和婴幼儿中进行筛查,从而可有效地防止在高危人群中使用氨基糖苷类抗生素。他说,“mtDNAA1555G突变检测试剂盒”主要由DNA提取部分、PCR部分、Prev-DAF专用试剂组成,可用来大规模快速筛查和鉴定药物性耳聋的线粒体A1555G突变。其中Prev-DAF专用试剂的成本仅为Alw26的1/50~1/100,其操作步骤及所需时间与Alw26酶切法基本相同,鉴定结果与Alw26酶切加直接测序结果完全一致,且Prev-DAF鉴定试剂分解的是突变型分子,Alw26切的是野生型分子,Prev-DAF鉴定阳性直接提示mtDNA1555A-G突变的存在,无假阳性和假阴性结果出现,诊断准确率达100%。

        另外,“线粒体DNAA1555G突变检测试剂盒”包含了必要的辅助试剂和阳性、阴性对照DNA标本,以保证基层和边远单位能够有条件开展这一检测项目,为在全国范围内实行mtDNA1555A-G突变的筛查和抗生素应用前的预防性检测提供了有力的工具,从而有可能从根本上减少对氨基糖苷类抗生素敏感的个体发生药物性耳聋的可能。

        戴主任建议,国家应尽快建立此项目的常规分子诊断,将此项基因突变筛查列入新生儿疾病筛查重点项目,从而建立氨基糖苷类抗生素用药前此突变检测的快速通道,鼓励医师使用氨基糖苷类药物前检测线粒体1555突变,避免耳聋及相应医疗纠纷的发生。

        戴主任最后总结说,线粒体大片段缺失分析、线粒体DNA定量分析以及重点耳聋的全频谱基因芯片检测技术,将是今后耳聋分子诊断的发展方向。从而最终做到有针对性地检测任何一个耳聋相关基因,真正在分子水平实现耳聋病的诊断、治疗、预防以及预后判断、遗传咨询(产前诊断)等目标。


    (责任编辑:labweb)

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