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    核酸检测新革命--聚合酶链反应

    日期:2017-12-31 23:10:47 来源: 检验视界网 作者:郑凯 点击:
        前言:DNA、RNA等遗传物质对于人类和病原体生物的繁衍生息起着关键性的作用,已得到世界一致的公认。由PCR(Polymerase Chain Reaction -聚合酶链反应)阐明的遗传信息,现在已成为一些临床检验的基础,并且今后将在分子诊断领域掀起一场史无前例的“革命风暴”。

        人类利用遗传学的实践拥有悠久的历史,早在公元前,人们就开始利用天然微生物产生的酶生产奶酪和酒。进入工业革命时代,人们又开始对微生物进行筛选和诱变,生产某些简单的代谢产物、氨基酸、维生素和抗生素等等,最终造福人类。20世纪60年代至今,随着人类对遗传物质的不断深入探索,DNA重组技术的出现,广泛应用于农业、工业、法医鉴定、医学、考古研究、环境监测、分子克隆及基因序列分析等重要领域和学科,具有广泛的发展前景,这就是我下面要为大家介绍的PCR技术。

         因此,了解以PCR为基础的诊断学是如何检出存在于感染性疾病中的病原菌和单纯遗传性疾病中的突变显得尤为重要。此外,许多传统上认为不是遗传性的疾病,现在则看作是遗传易感性疾病或由遗传介导的对外界刺激适应不良性疾病。

        1971年Khorana教授等人首次提出在体外经DNA变形,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想,但由于测序和引物合成的困难,以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能,所以Khorana的设想被人们遗忘了。直至1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到了实现,并于1993年荣获诺贝尔化学奖;1988年Saiki将耐热DNA聚合酶(Taq)引入PCR,进一步完善了这项技术;1989年美国《Science》杂志将PCR列为十九世纪十余项重大科学发明之首,从此整个分子诊断领域顿时沸腾起来。

        PCR技术应用实例之亲子鉴定

        利用法医学、生物学和遗传学的理论和PCR技术,从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点,分析遗传特征,判断父母与子女之间是否存再亲生关系。DNA亲子鉴定:也叫亲权鉴定,是PCR技术应用的其中一项典型案例,也是法医物证鉴定的重要组成部分。

        原理: 每人有23对(46条)染色体,同一对染色体同一位置上的一对基因称为等位基因,一般一个来自父亲,一个来自母亲。如果检测到某个DNA位点的等位基因,一个与母亲相同,另一个就应与父亲相同,否则就存在疑问了。

        步骤:

        第一步:把样本(血液、毛发、唾液、口腔细胞等)细胞核中所含有DNA提取出来,然后进行一定的纯化(去除杂质)。

        第二步: PCR扩增这步就是把我们所需要的片段通过酶促反应,在PCR仪上进行大量复制,放大到通过某些专用仪器可以看到的程度。

        第三步:接下来PCR后反应主要是上测序仪检测的准备阶段,将双链的DNA打开,加入检测用的的内标,主要是用来标记检测的片段长度。

        第四步:由于DNA带有电荷,通过毛细管电泳的方法,不同片段DNA长度的电泳速度不同,在同样的电压,同样的电泳时间下,泳动的距离不同,这些长短不同距离可以通过前期加入的内标测量分辨出来,同时可通过一定的软件显示在电脑上,方便检测人员处理和分析数据。

        第五步:分析数据,出具报告,主要是检测人员将所得结果进行分析汇总、计算,然后出鉴定结论和报告。

        PCR的一个主要长处是目的DNA片段不需要从背景DNA中纯化。另外,几乎可以用任何组织或体液,包括新鲜与存档的手术标本经PCR来诊断疾病。而且,DNA是相对稳定的分子,所以甚至可以从古代木乃伊或冷冻的组织中获得样品。指数扩增使得PCR具有极高的敏感性。而独特引物的使用则使其具有高度特异性。由于在PCR中一个参数增高另一个也会增高。因而不像其他检测方法常为提高特异性而削弱敏感性。当前人类应用PCR的兴趣点主要集中在从病原体和患者基因组中扩增与检测具有诊断价值的DNA片段。

        虽然PCR这项技术在分子领域可谓“大放光彩”,但同时也存在一定的局限性。首当其冲过程依赖于引物介导的DNA复制,因此必须具有DNA序列标本信息。另一个缺点是,能可靠扩增的诊断性DNA片段最长约1000个碱基对。如果从存档组织块中提取DNA(由于DNA已部分变性)的话,这是远远不够的。因此,对人类含有许多外显子的长基因,如囊性纤维化乳腺癌基因,PCR不适合于作为进行详尽突变分析的工具。

        扩增靶DNA的能力具有双重性,其检测敏感性虽无可比拟,但同时也产生数以亿计的低分子量DNA拷贝。如果形成烟雾片段悬浮于空气中的话,这些“残留的”DNA会迅速污染试剂、仪器和实验人员,并通过错误扩增的模板污染以后的实验。因此,PCR操作需要专门设计的多室性(至少三间工作室)实验室,特殊培训的人员,严格的实验操作以及阳性和阴性对照,只有这样才能最大限度地减少假阳性结果。

        PCR技术分类及扩展应用:

        1、原位PCR( in situ PCR)技术:

        原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术,使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞(爬片、甩片或涂片)或组织(石蜡、冰冻切片)上直接对靶基因片段进行扩增,通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法,在各类病理组织诊断中得到广泛应用。

        2、锚定PCR(Anchored PCR,APCR)技术:

        用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。可用于扩增未知或全知序列,如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

        3、不对称PCR(asymmetric PCR)技术:

        两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50~100:1比例。在最初的10~15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA,可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。

        4、反转录PCR(reverse transcription,RT- PCR)技术:

        当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT-PCR应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

        5、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术:

        这个也是大家非常熟悉的方法了,qPCR可用于研究基因表达,能提供特定DNA基因表达水平的变化,临床上在癌症、代谢紊乱及自身免疫性疾病的诊断和分析中很有价值。

    (责任编辑:zqg)

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