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    临床实验室儿童参考区间制定的流程与挑战

    日期:2017-10-27 20:53:11 来源:中华检验医学网 点击:
    检验项目的参考区间是指参考下限和上限之间的分布区域,通常是正常个体检测结果95%的分布区间[1]。儿童检验指标参考区间的制定对儿科临床的疾病诊断、疗效观察、预后判断及健康评估都起着至关重要的作用。但因儿童的自身特点,如生长发育快、不同发育阶段检验指标的参考区间存在明显差异等,使得儿童检验指标参考区间的制定更加困难。因此,在制定流程时需根据儿科专业特点进行研究方案的优化设计,并考虑儿童研究中的伦理学等问题。本文介绍直接法或间接法建立儿童参考区间,在借鉴成人研究团队经验的基础上[2,3,4,5,6],为临床实验室制定儿科参考区间提供方法学思路。 CLSI最新制定的指南C28-A3中指出建立参考区间的基本过程为:(1)选择参考人群;(2)筛选参考个体;(3)形成参考样本组;(4)获得参考值;(5)得到参考分布、参考限和参考区间[1]。其中"筛选参考个体"是建立儿童参考区间的重点和难点。CLSI C28-A3建议首选直接抽样技术,但当标本采集困难时,如低龄儿童或脑脊液等难以采集的标本,建议使用间接抽样技术。本文遵循CLSI C28-A3指南和我国的行业标准《临床实验室检验项目参考区间的制定》WS/T 402-2012[7],考虑儿童群体与儿科临床专业特点,就儿童检验指标参考区间制定的流程做如下探讨。 一、直接法建立儿童参考区间的流程与关键技术 加拿大[8]和德国[9]研究均采用直接法,通过直接抽样技术选择参考个体,即采用事先规定好的入组和排除标准从参考人群中选择正常参考个体建立参考区间[1]。通过多个研究中心参与,可扩大参考个体数量来保证建立的参考区间更加具有代表性,研究流程如下。 (一)儿童参考个体的选择 1.制定儿童参考个体筛选的纳入和排除标准: 制定纳入和排除标准时应尽可能考虑到对结果有影响的因素,以便临床医生选择合适个体,并且针对不同的检验项目可选择不同的筛选标准[7]。(1)对于儿童参考个体的选择,应充分考虑儿童各年龄段和不同性别生长发育及营养的指标等一些协变量的影响(体重指数、性征发育等)。(2)排除儿科疾病及其治疗情况的影响(近期的急性疾病、慢性疾病、服药史、手术及输血等),其中儿科疾病至少要考虑到急、慢性感染、先天性心脏病、自身免疫性疾病、血液系统疾病、神经系统疾病、肝胆疾病、急性或慢性肾病、哮喘、遗传代谢病及肿瘤等。(3)排除服用儿童保健品(维生素、钙等)对检测结果可能造成的影响。(4)建议考虑儿童不同的发育阶段,必要时针对不同的年龄分层设定不同的纳入和排除标准(如:新生儿阶段的纳入、排除标准与其他年龄段差别显著)。 2.制定参考个体筛选的调查问卷和体检表: 设计调查问卷和体检表时,应尽量体现儿童临床特色。考虑到儿童很少罹患慢性疾病,因此对亚临床状态人群的鉴别相对成人更具可行性。此外,设计体检内容时,应考虑儿童对体检的依从性,体检项目尽量选择关键项目,宜少不宜多。建议问卷调查的基本内容应包括:性别、出生日期、民族、现住址、既往史、服药史、家族史、出生时的状态、婴儿喂养方式等;体检的主要内容包括儿童生长发育相关指标如身高、体重、性征、皮褶厚度以及肌张力检查、心肺听诊、肝脾触诊及相关实验室检查等。此外,应注意按照儿童发育的不同阶段[新生儿期、婴儿期、幼儿期、学龄前期、学龄期、青春期/青春发育期(要考虑性别差异)]设置相应的问卷和体检表[10] 3.确定抽样方法: 开展多中心研究时,应考虑研究所覆盖地区的代表性,以及实验室筛查条件和仪器类型、医疗机构的实施能力、组织能力和所涉及的检验项目的检测水平及能力等。各实验室所筛选的参考个体应能代表医疗机构所覆盖的人群,抽样时不局限于某个单位,在城区、郊区、农村分别招募健康参考个体。可以选择医院产科、社区、妇幼保健机构、开展儿童保健服务的医院和幼儿园及学校的不同班级为抽样对象,尽量不选择住院和门诊患儿[1,7]。抽样时应尽可能地涵盖0~18岁不同年龄和性别的均匀分布以保证抽样的代表性。采取随机抽样的方案选择参考个体[1,7],而对于幼儿园、中小学生等群体活动的儿童,可以整群抽样。 4.样本量的估算: 在开展多中心研究设计时,要充分考虑各地区之间的可能差异,尽量保证允许各中心独立建立参考区间的样本量,以便当某分中心的参考值分布与总体存在统计学意义差异时,可以建立和使用符合其人群特征的独立参考区间。 根据CLSI C28-A3的建议,以非参数方法估计样本的参考区间,研究对象至少需要120例,以获得对参考限值的90%置信区间的稳健估计,如果需要分组则每组至少120例。但是,儿童处于生长发育期,有的检测项目会随着年龄或发育阶段的不同而不同,因此在估算样本量时需要充分考虑拟研究检测项目随年龄变化的特点而划分年龄组,每年龄组男女比例为1∶1。此外,应保证每年龄组均纳入足够的样本。对于新生儿和婴幼儿,可采用CLSI C28-A3提出的稳健方法[1,11],满足最小样本量为20例,但建议最少招募40例,当招募至80例时,建立的参考区间与120例的结果更为接近。应注意的是:无论样本量大小,最终须采用非参数方法统计。 (二)参考样本分析前的准备 为减少参考样本对试验结果的影响,要做好分析前的准备。包括参考个体的状态、样本的采集、处理、运送与储存等。可参照行业标准WS/T402-2012的相关要求进行分析前准备[7] 1.儿童医学研究中的伦理学考虑: 因为儿童处于生理和心理的发育阶段,因此在开展儿童研究的过程中知情同意实施的规范化显得非常重要。在研究前,项目组的研究方案应获得机构伦理委员会的审批;在研究过程中应严格遵循国际上对于儿童受试者参加临床研究的相关要求。本研究规定对于9岁以下的儿童受试者的知情同意需得到其父母或者法定监护人的同意;对于9岁及以上的儿童受试者除了得到其父母或者法定监护人的同意外,还必须征得儿童本人同意。 2.参考个体的状态: 参考个体的状态是指对临床决策具有影响的状态,在标本采集前,应考虑到参考个体先前的饮食情况、禁食或非禁食、药物和保健品的摄入与禁忌、生物节律和取血时间、运动状况、采集前休息的时间及参考个体情绪的影响[7]。例如:对于一些需要空腹采血的检测项目,既要保证血标本采集的质量,又不能使低龄儿童(如新生儿等)禁食过久而致低血糖。在低龄儿童所需空腹时间尚未达成共识的情况下,可根据儿科护理专家临床经验,遵循以下规律来控制禁食时间:母乳喂养禁食2~3 h;配方奶喂养禁食3~4 h;若已经添加辅食,进食如面条,稀饭,一般禁食5~6 h;若进食米饭、肉类等和成人一样饮食,至少禁食8 h。同时尽量避免情绪的激动,若受试者情绪激动时,应尽量用言语进行安抚,待其平静后方可进行采血。 3.样本采集: 实验室应制定标本采集手册,以便指导标本的正确采集。标本采集手册的内容应明确检验项目的标本类型、抗凝剂选择、标本采集量、标本采集部位与方式、采集时间等。而在样本类型的选择及样本的采集方式等方面要更多考虑儿科的特殊性。如儿童血液标本采集时要考虑的问题包括:(1)针对检验项目的临床需要可能采用不同的标本类型(如:全血细胞分析除静脉血外,根据临床需要,有些医院还需要制定儿童末梢血参考区间等)。(2)标本采集的部位和体位的要求:对于静脉血采集,新生儿及小于4个月的婴儿行颈外静脉和头皮浅静脉采血,可采取侧卧位;其他年龄段儿童视采血部位而定,3岁以上的儿童多行肘正中静脉或贵要静脉穿刺采血,以坐位采血为最佳。采集末梢血时,≤28 d的新生儿采集足跟血;≥29 d的婴幼儿及儿童参考个体建议采集无名指尺侧手指血。(3)采集次数和采血量的要求:世界卫生组织采血指南的静脉采血的最佳操作要求对于儿童应严格设定有限的采血次数[12]。如果经过两次尝试均未取到满意的血样,应该慎重考虑是否继续尝试或取消采血。根据美国微生物学会发布的《微生物实验室诊断传染病的指南》对于儿童采血量的要求,当儿童血容量在200~800 ml之间(体重在2.1~12.7 kg之间),采集血样本量应≤3%的全血容量[13] 4.样本处理和储存: 参照行业标准WS/T 225要求[14] (三)参考样本的检测 分析系统的选择与性能要求及标本检测规范等,需遵循WS/T402-2012的相关要求[7] (四)数据的清理与参考值的统计分析 参照CLSI C28-A3要求分析数据。(1)离群值检查:按照Dixon方法检查并剔除离群值。(2)根据性别或者年龄等因素进行亚群划分,并对不同亚群进行正态性检验。如果各亚群属于正态分布,则亚群之间的比较可以采用Z检验。如果各亚群数据属于偏态分布,则可以按照以下两种方法进行分析:采用非参数检验(如秩和检验等)进行分析比较;将偏态分布的数据经过简单的正态性转化(如log转化)后,采用转化数据进行Z检验,以比较各亚群之间的异同。最终根据统计分析的结果,判断是否需要分组。(3)参考限和参考区间的建立:参考限是指从参考分布得到的界限值,用于描述部分参考值的位置。在确定参考限时,大多数分析物以参考值分布的2.5%为低限,以97.5%为高限。当只有单侧参考限具有临床意义时,通常以97.5%为高限。进一步计算参考限上、下的90%置信区间,以便评价参考限的可信度。介于参考下限和上限之间的分布区域即为参考区间,通常代表参考个体检测结果95%的分布区间。 (五)参考区间的报告 根据具体指标检验值的分布特征,选择以下三种方式之一报告其参考区间:(1)年龄独立,联合性别;(2)联合年龄,独立性别;(3)独立年龄,独立性别。 二、间接法建立儿童参考区间的流程与关键技术 虽然直接法建立参考区间具备研究对象代表性好、结果相对可靠等优势,但直接抽样技术获取儿童参考个体和血标本存在一定困难,国内外同行近年来致力于间接法的研究,即采用已建立的数据库(如标准的实验室信息系统)中的实验室大数据来建立参考区间[1]。目前常用的间接抽样方法有Hoffmann法和改良Hoffmann法[15,16,17,18,19]。如国外Arzideh等[16]通过收集欧洲2个地区的14家实验室的血清肌酐数据,利用间接抽样的方式建立了血清肌酐的正常参考区间;我国上海潘柏申教授团队用间接抽样法建立了ALT的参考区间[17]。上述两个研究经过与直接抽样技术的比较,发现间接法建立参考区间与经典的直接法建立的参考区间非常一致。本研究团队也应用北京儿童医院检验中心数据使用间接抽样法建立了儿童的红细胞计数参考区间[19]。采用间接法建立参考区间的研究流程如下。 (一)数据来源与采集 因临床实验室数据同时包含正常儿童和患病儿童,CLSI C28-A3建议该技术更适用于相对健康个体来源的数据。比如对献血者、常规体检进行定期筛查个体、铅筛查个体、外科小手术患者等检验的结果作为间接抽样技术的研究数据。因此,研究设计时需明确数据来源和数据采集的方式。关于数据采集样本量大小目前尚无共识。Henderson的研究应用1 769份儿童样本检测结果[20];本研究组采用了48.9万份结果数据[19] 无论采集何种来源的检验结果数据,在选择研究对象时值得关注的两个方面:(1)医院数据获得的常规检验指标结果的准确性是保证间接抽样大数据挖掘代表性的基础。因此,对常规检测的标准化和质量保障非常重要(包括检测系统的完整性、室内质控的精密度符合要求、标准化操作及参加室间质评活动结果满意等)。(2)儿童医学研究中的伦理学考虑:采用医院大数据建立儿童参考区间的研究项目应通过医疗机构伦理委员会的审批。在数据导出的过程中,应采取双盲的方法。导数据和统计分析时应注意患儿信息的保密性。 (二)大数据的清洗 来源于医院实验室检测结果的数据,在应用前须进行数据清洗,以去除干扰并保证数据的完整性。(1)查找重复值:实验室信息系统中收集的患者就诊卡号/住院号、姓名、性别和年龄信息相同者可作为重复值并须将其删除。(2)查找的缺失值:采用统计学软件查找包含性别、年龄和相关检测指标的缺失值,任何一个变量有缺失,即删除该条观测[19]。(3)去除离群值:通常采用Dixons法[21]、四分位间距法查找异常值,经临床评估后,去除离群值。 (三)数据分布的验证与转换 应用Hoffmann法或改良Hoffmann法是基于正态性分布从医院实验室数据中划分正常参考组,所以首先要进行数据分布的验证,对于非正态分布的数据,通常应用Box-Cox变换将其转变为近似正态分布,并对转换后的数据使用偏度-峰度值检验分析其正态性。 (四)正常参考个体的分离 间接抽样技术的研究对象不是参考个体,而是实验室检测结果。通常是用统计学方法(如:模式识别、机器学习等),从检验项目已有的数据中,将"正常的"部分划分出来,利用这些数据估算参考区间。常用的Hoffmann法是基于累计概率分布来选择正常参考样本,该法的实现步骤为:(1)按照事前的定义(如年龄、性别、实验室、同一个体有多次检测数据时取哪一个)从已有数据库中选择用于分析的数据。(2)删除离群值并显示被删除离群值的数目。(3)根据某项检验指标的数据分布,绘制累积概率分布图。(4)设定线性部分误差大小,将累积概率分布中的线性部分选出来,作为正常参考样本组。 (五)参考区间建立 用Hoffmann方法建立各组数据的95%分布区间,计算参考区间上、下限值及90%置信区间。确定第2.5%和第97.5%百分位数的范围。间接抽样技术实施的关键问题在于Hoffmann等分类技术的实现,因此,如何编程实现技术是一个关键问题。应采用专业的统计学软件并利用其强大的可视化技术和编程,由专业的统计人员实现该技术的应用。 三、直接法与间接法建立儿童参考区间的比较 (一)直接法建立参考区间的优势和挑战 1.优势: 直接法是建立参考区间的经典方法,也是国际临床化学联合会(International Federation of Clinical Chemistry, IFCC)的推荐方法,且有CLSI C28-A3及我国WS/T 402-2012行业标准为指导依据。其样本来源于经过筛选的参考个体,人群代表性好,结果准确可靠。 2.挑战: 主要体现在建立儿童参考区间分析前过程中的困难:(1)儿童血液标本采集困难:世界卫生组织采血指南[12]指出给儿童及新生儿血液采样的人员必须经过良好的静脉穿刺技术的培训和操作练习。并且对于儿童应严格设定有限的采血次数和标本采集量。(2)儿童参考区间建立需要的参考个体例数比成人更多:直接法建立参考区间时,为获取每年龄组儿童的检测数据,所需参考个体量要远大于成人。特别是在新生儿和婴幼儿期,血容量明显低于较大年龄段儿童和成人,且红细胞压积较大而血清或血浆的含量较少。如果通过直接抽样法建立儿童常规项目参考区间,除血浆或血清需要量较大外,有些项目还要考虑增加末梢血采集等标本类型,当一个儿童的取血量不能完成所有常规项目参考值的测定时,还需要多名同龄儿童的标本方可满足建立参考区间的需要。因此,入组的参考个体数量和实验的检测量均大于成人。如流行病学调查中再要考虑地区分布的差异等,样本需求量会更大。(3)从伦理学考虑:以儿童健康志愿者作为受试者,存在个人意愿和法定监护人意愿等的影响,而且针对儿童的特殊伦理考虑也是需要关注的问题,这些都为选择人群带来困难。 (二)间接法建立参考区间的优势和挑战 1.优势: 间接法最大的优点是直接利用实验室数据,可以节省大量的人力和物力[22]。在没有条件采用直接抽样技术时,特别是对于某些特殊人群(新生儿、青春期、老年人)、很难从健康儿童获得的标本(脑脊液、骨髓等),可通过采用间接抽样技术直接利用医院实验室数据在较短的时间内获得参考区间,免去建立儿童参考区间标本采集的困难。 2.存在的问题: 间接法不是直接利用人群,而是间接地利用检验数据,人群的代表性可能不如直接抽样法[23]。通过间接抽样技术产生的参考区间都应被认为大致的估算,因为无论采用何种统计学技术对数据进行清洗,都不能完全保证所纳入的数据来自于健康个体。所以,条件允许的情况下尽可能采用直接抽样技术建立和验证参考区间[1] 三、参考区间的转换 (一)参考区间转换的临床需要 当实验室没有能力通过直接抽样和间接抽样技术建立参考区间时,或者当实验室引进一个新项目、检验指标的分析方法有改变及所服务的患儿人群变化时,临床实验室可应用其他实验室或诊断试验生产商提供的参考区间进行转化[1] (二)参考区间转换的方法 进行参考值的转化需要满足一些必需条件。首先转化的基础是正确建立原始参考区间,其次参考区间的转化还涉及2个重要问题:分析系统的可比性和实验项目人群的可比性[1] 1.分析系统的可比性: 在某些情况下,实验室针对相应人群、特定的检测方法建立了特定分析物的参考区间,并且已经形成了文件体系。当实验室要改变检测方法时,就没有必要重新收集参考个体样本建立新方法的参考区间。实验室可以选用任意患者的新鲜标本进行两种方法学的比对实验(采用CLSI EP09),通过比对可以评价是否转换现有参考区间或者建立新的参考区间。总体上,如果检测系统有相似的精密度和已知的干扰,采用相同的或具有可比性的标准品或校准品,测定结果也具有可比性,则可进行参考区间的转化。具体的转化方法和结果判断参见CLSI C28-A3[1]。但值得注意的是:(1)应按照EP09文件的要求,选择合适的数据纳入。一方面,数据分布没有足够的代表性,则会低估了两种方法的相关性;另一方面,如果纳入的数据的范围过大(极大值和极小值较多),则会过度估计两种方法的相关性。(2)观察线性回归方程,应注意其截距的大小。如果与参考区间相比,截距偏大,则不能进行参考区间转换,应筛选参考个体重新取样,建立新的参考区间。(3)有些检测项目,比如钠离子,其变量分布具有非连续性的、离散的整数型分布特点。在这种情况下,不建议使用线性回归的方法转换参考区间,而可用两种方法之间的平均偏倚来校正参考区间[1] 通过转化建立新的参考区间,需进行小样本参考个体(20例)验证。对于因年龄、性别等差异而分组设置的参考区间,实验室通过参考区间转换后,不必对新建立参考区间的所有分组均进行验证,而仅需验证其中一组参考区间即可。 2.检验项目人群的可比性: 如果一个实验室希望对其他实验室的参考区间进行转换(采用相同或具有可比性分析系统)或对诊断试剂制造商建立的参考区间进行转换,则需考虑参考人群可比性的问题,如:不同地域、种族、海拔、饮食生活习惯等因素。此外,参考区间研究中其他分析前过程也要具有可比性,例如参考个体的准备,标本的收集和处理过程。目前这种情况在临床实验室中比较多见。这种参考区间的转换也需要进行验证[1] 因参考区间的转换是以分析系统的可比性和实验项目人群的可比性为基础并通过线性回归建立了新、旧两个参考区间的数学转换模型关系。鉴于线性回归本身可能存在的转换误差,建议参考区间的转换均以原来通过建立所获得的参考区间为基准进行,而不能以新的参考区间为基准进行转换的再次传递。 四、实验室对参考区间的验证评估 建立和转化的参考区间均需要进行临床验证,以评估其临床适用性。 (一)实验室验证方法 根据CLSI C28-A3,参考区间的验证分有直接使用(主观评价)、小样本验证和大样本验证。 1.直接使用: 实验室通过评价其与其他实验室或诊断试剂制造商建立参考区间的分析前、中、后程序,参考区间的估计方法,参考人群的地理分布和人口统计学资料完全一致时,参考区间可不经验证直接使用。 2.小样本验证: 每个项目应按照新建立参考区间相应的年龄与性别分组进行验证。各参加验证单位遵循筛选标准从本地参考人群中招募参考个体20例,采样并测定,测定值剔除离群值后若不满20例需补足。将20个测定值与需验证的参考区间比较,若落在参考区间外的测定值不超过2个,则参考区间可以直接使用;若3个或3个以上测定值超出,则需要重新筛选20例,重复上述操作,同样若不超过2个测定值超出该参考区间的可以使用,若仍然有3个或3个以上测定值超出,则实验室应该重新检查参考区间建立过程,总结分析原因,考虑是否需要重新建立参考区间。 3.大样本验证: 对于一些重要项目的参考区间验证可以加大参考个体的样本量,采用60个测定值与需验证的参考区间比较。 (二)参考区间临床适用性的定期评估 建立的参考区间应经过临床专家的同行评议,以考察其临床适用性。并且在临床应用后可参考CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可准则》关于参考区间临床适用性的定期评估方面的规则进行定期追踪评估。当特定的生物参考区间不再适用服务的人群时,应进行适宜的改变并通知用户。如果改变检验程序或检验前程序时,实验室应评审相关的参考区间的适用性。必要时重新建立临床适用的参考区间[23] 虽然临床实验室制定儿童参考区间存在困难,面临着挑战,但可以通过多种途径得以实现。当人、财、物等支持条件允许时,尽量采用直接抽样法建立参考区间;也可以应用间接法通过数据挖掘估算参考区间。具体流程见图1。另外,在系统和人群可比性的基础上,可通过转换其他实验室、参考文献以及诊断试剂制造商等建立的参考区间。建立和转换的参考区间都应进行验证和追踪评价以保证其临床适用性。

    (责任编辑:lgh)

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